Obserwowanie reakcji zachodzących wewnątrz żywych komórek, a nawet w ich organellach, takich jak jądra komórkowe umożliwia nowa metoda śledzenia reakcji chemicznych za pomocą jednej z superrozdzielczych technik mikroskopowych, opracowana w Instytucie Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk  w Warszawie. Badania te finansowane są z grantów MAESTRO Narodowego Centrum Nauki i ERA Chairs w ramach programu Horyzont 2020.

Dopiero od niedawna mamy do dyspozycji narzędzia pozwalające bezpośrednio przyglądać się zjawiskom chemicznym zachodzącym w żywych komórkach. Z powodu ograniczeń technicznych wciąż nie mamy jednak tak podstawowej wiedzy, jak ta o wartościach stałych równowagi reakcji chemicznych w komórkach – czyli o tym, jaka część substancji chemicznych zaangażowanych w daną reakcję występuje w komórce w formie przereagowanej, a jaka w nieprzereagowanej.

Przeciwności te udało się pokonać naukowcom z IChF PAN. We współpracy z berlińską firmą PicoQuant GmbH opracowali oni i zademonstrowali modyfikację jednej z najnowocześniejszych technik mikroskopowych: superrozdzielczej spektroskopii korelacji fluorescencji.

– Reakcje biologiczne są na ogół odwracalne i tam, gdzie zachodzą, zwykle wytwarza się pewna dynamiczna równowaga między ilością substancji przereagowanych a związkami nieprzereagowanymi  –  tłumaczy prof. dr hab. Robert Hołyst z IChF PAN. – Próbując wyznaczyć stałe równowagi dla różnych reakcji w komórkach sięgnęliśmy po superrozdzielczą spektroskopię korelacji fluorescencji. I tu natknęliśmy się na ciekawy problem techniczny, którego rozwiązanie otworzyło nam nowe możliwości w badaniu chemii życia – dodał.

Istnieje wiele odmian mikroskopii. Niektóre z nich umożliwiają nawet dostrzeżenie pojedynczych atomów. Jak jednak podkreśla IChF PAN, przy obserwowaniu komórek bezkonkurencyjna pozostaje mikroskopia optyczna, z uwagi na małą inwazyjność i możliwość obrazowania struktury przestrzennej żywych organizmów. Jej podstawową wadą przez długi czas była jednak słaba rozdzielczość: fundamentalne ograniczenia fizyczne (dyfrakcyjne) powodują, że standardowymi technikami optycznymi nie można rozróżnić szczegółów mniejszych od ok. 200 nanometrów.

Jedną z odmian mikroskopii optycznej jest mikroskopia fluorescencyjna. Polega ona na wprowadzeniu barwnika fluorescencyjnego w badane miejsca próbki biologicznej, a następnie skanowaniu próbki zogniskowaną wiązką lasera. W ten sposób cząsteczki barwnika znajdujące się w ognisku zostają pobudzone do świecenia. Przepuszczając wyemitowane przez nie światło przez specjalny otwór (konfokalny) można otrzymać obrazy o podwyższonej rozdzielczości.

W odmianach superrozdzielczych ognisko lasera ma tu objętość liczoną w dziesiątkach attolitrów (jeden attolitr to miliardowa część jednej miliardowej litra). Pomiar polega na mierzeniu światła emitowanego przez barwnik fluorescencyjny doczepiony do badanej cząsteczki, wzbudzony przez wiązkę laserową. Znając rozmiary ogniska i czas trwania fluorescencji oraz wspomagając się odpowiednimi modelami teoretycznymi, można tu dość precyzyjnie ustalić prędkość ruchu nawet pojedynczych cząsteczek.

– Od pewnego czasu było wiadomo, że o ile superrozdzielcza mikroskopia FCS sprawdza się przy obserwowaniu cząsteczek poruszających się w dwóch wymiarach, np. w membranach lipidowych, o tyle zawodzi przy obserwacjach w pewnej objętości  – mówi dr Krzysztof Sozański z IChF PAN. – Czasy dyfuzji, wyznaczane na podstawie pomiarów w 3D, potrafiły się różnić od przewidywań z pomiarów w 2D o rząd wielkości, a nawet więcej. Po kilku miesiącach badań stało się dla nas jasne, że za te rozbieżności odpowiada zbyt uproszczony sposób wyznaczania przestrzennych rozmiarów ogniska – wyjaśnił.

Na podstawie własnych analiz teoretycznych oraz doświadczeń warszawscy naukowcy, finansowani z grantów MAESTRO Narodowego Centrum Nauki i ERA Chairs europejskiego programu Horyzont  2020, skonstruowali nowy, uniwersalny model teoretyczny, wprowadzający korektę przestrzennego kształtu ogniska i uwzględniający jej wpływ na zmierzony stosunek sygnału do szumu. Poprawność modelu początkowo zweryfikowano w pomiarach szybkości dyfuzji różnych fluoryzujących próbników w roztworach.

Ważną cechą metody analitycznej opracowanej w IChF PAN jest fakt, że do jej stosowania nie są potrzebne zmiany w aparaturze. Po odpowiedniej adaptacji metoda może być użyta w celu dokładniejszego interpretowania danych zarejestrowanych przez już wyprodukowane mikroskopy korzystające z techniki STED.

Europejski grant ERA Chairs o wartości 2,4 mln euro został przyznany Instytutowi Chemii Fizycznej PAN w 2015 roku jako jednej z zaledwie trzech instytucji naukowych w Polsce.  Główne zadanie grantów ERA Chairs to przyciągnięcie najwybitniejszych uczonych do czołowych instytucji naukowych zlokalizowanych w krajach o niedostatecznych nakładach na badania i rozwój. Dalekosiężnym celem jest podniesienie poziomu konkurencyjności jednostek naukowych o dużym potencjale do pułapu umożliwiającego skuteczną rywalizację z czołowymi ośrodkami naukowymi, zarówno Europy, jak i świata.

(Źródło: IChF PAN)